1. 培养基的配制
植物组织培养最常用的培养基为MS培养基,其中包含几十种化合物,在配制培养基时切忌“一锅煮”,就是不能将各种化合物一齐添加进去,因为有些化合物相遇会发生化学反应产生沉淀,影响培养基的营养成分,因此,一定要等到一种成分溶解之后,再缓慢的添加另一种成分,使其成为均一、无沉淀的培养基。
另外,培养基的pH值会对培养基的硬度造成影响。若将培养基的pH调的过高,则会使培养基变硬,进而增加了接种的阻力,从而对外植体造成损伤。若将培养基的pH值调的过低,则会使培养基不能凝固,起不到固定外植体的作用。因此,将培养基的pH调节至6.0即可。
2. 外植体的选择
为了使接种后的诱导得以成功,选择的外植体应该是幼嫩的、处于生长旺盛时期的。而且选择的外植体的体积不能过小,如若过小则会影响愈伤组织的形成,从而影响进一步的分化。因此,一般接种的外植体体积在0.5~1.0cm2的范围内即可。
3. 消毒
外植体的消毒主要分为两个阶段。首先是初次消毒,先用流水冲洗,然后用洗衣粉水进行刷洗,以去除表面的污垢,最后用流水冲洗20min,完成第一次的消毒。接下来的消毒步骤要在超净工作台中进行,在各种消毒剂中升汞的杀菌效果最好,但由于其中含有重金属,且实验后的收集工作不易,因此在中学实验中不推荐使用升汞。采用酒精消毒30s,2%~10%的次氯酸钠消毒8~10min即可达到同样的消毒效果。
4. 接种
首先,点燃酒精灯,用酒精棉球擦拭双手,再擦拭实验用到的器械,然后在火焰上反复灼烧,放置一旁待到器械温度不高时方可用其进行操作,以免将外植体烫伤。操作过程中,避免双手在培养皿上方来回通过造成外植体的污染,可以在每次修剪完外植体后将培养皿的盖子盖上,以降低污染率。接种前,要将培养基的瓶盖在火焰上迅速灼烧(由于目前大部分学校都在使用塑料组培瓶,因此一定要迅速通过火焰,以防损坏组培瓶),方可进行接种。
5. 培养
接种好的培养瓶放置于光照培养架上,每天给予10h的光照即可满足外植体分化对光照的需求。
6. 炼苗与移栽
待到无菌苗长至组培瓶的瓶口时即可进行移栽,如若不移栽,则会影响植株的进一步生长,最终导致植株的死亡。移栽之前,首先要对组培苗进行炼苗,具体做法为先闭瓶锻炼3d,再开瓶锻炼3d,以培养基上开始长菌为移栽的标准。
移栽前,一定要将根部的培养基洗净,如若没有洗净,在种植于土壤中时,培养基的营养成分会加剧土壤微生物的生长,降低组培苗的移栽成活率。为了提高组培苗的成活率,可先在灭过菌的珍珠岩或蛭石上培养使根系发达再转移到土壤中。