超滤管使用方法和注意事项
蛋白浓缩和换
Buffer
通常使用的超滤管,常用
Millipore
的
Amicon-Ultra-15
超滤管
(
MWCO10kD
)。也有其它型号的、不同体积大小和
MWCO
超滤管可选,视目的蛋白的分子量
与浓缩前体积、浓缩目标体积而定。可重复使用。
1
、
选择合适的超滤管,
主要考虑
MWCO
和浓缩体积,
通常应截留分子量不应大于目的蛋
白分子量的
1/3
,比如目的蛋白分子量为
35kDa
,就可以选择
10kDa
截留分子量的超滤管。
若目的蛋白分子量为
10kD
左右,则可以用截留分子量
3kD
的超滤管。
2
、
新买来的超滤是干燥的,
使用前加入
MilliQ
水,
水量完全过膜,
冰浴或冰箱里预冷
几分钟。然后将水倒出,即可加入蛋白液,加入的多少,以不超过管顶的白线为准。操作要
轻,加入蛋白液前,超滤管需要插在冰上预冷。
3
、平衡。质量和重心二者都要达到平衡。注意转速和加速度不可太快,否则直接损坏
超滤膜。开始离心超滤(离心机预冷至
4
度)。膜与转轴的方向根据说明书调整(角转离心
机的情况是膜与轴垂直)
。
在实际使用中,
一般转速开的比说明书里的要低,
这样可以延长
离心管的使用寿命。
4
、当浓缩到剩下
1ml
时,
【取
50ul
国产
Bradford
溶液,加入
10ul
流穿,看有没变蓝
色,以此判断超滤管是否漏掉蛋白。如果管漏了,将上层和流穿重新倒入新管中开始超滤。
要精确判断是否漏管,
用
5mg/ml
的
BSA
离心
10min
,
再取流穿,
跑蛋白胶或
Bradford
粗测】
,
继续加入剩下的蛋白液浓缩(在冰上操作,防止蛋白受热),直到所有浓缩液都加完为止。
离心过程中注意是否发生蛋白沉淀,
导致堵管。
若发生沉淀,
要确定沉淀的具体原因,
是蛋
白浓度过高还是
Buffer
不合适;前者可用多根超滤管同时超滤,降低浓度的办法解决,后
者的方法是换不同的
Buffer
,直到蛋白不发生沉淀为止。
5
、前面几步用以浓缩蛋白,如果要换
Buffer
,在总蛋白液浓缩至
1ml
左右的时候,轻
轻加入新的
Buffer
(经
0.22um
超滤膜超滤),再浓缩至
1ml
左右,连续三次,最后一次的
浓缩终体积根据需要的蛋白浓度而定,一般不多于
500ul
,也有浓缩至
200ul
以内的情况。
按照每次至少
10
倍左右的体积浓缩算,三次达到
1000
倍以上,基本上可以达到换
buffer
的目的。
6
、取出最终蛋白浓缩液的操作在冰上操作,用黄枪头(
200ul
)取,轻轻顺着边缘插入
枪头,
轻轻吹打、
混匀蛋白液,
注意不要碰到超滤膜,
然后吸取浓缩液,
每次吸接近
200ul
,
直到吸完。
管底剩下的最后一点浓缩液不必吸取,
否则难度太大,有可能损坏超滤膜。
最后
加入
MilliQ
水到超滤管中,没过超滤膜,防止膜失水变干。
7
、以下是处理超滤管,重复利用超滤管的步骤。
8
、倒出超滤管里的水,用
milliQ
水轻轻润洗几次,
【若管底有可见的蛋白沉淀,可以
先加入水,然后用枪头吹打,注意不要碰到膜,吹打至沉淀悬起,然后倒掉,不可用自来水
猛冲】然后加入
0.2M
的
NaOH
溶液,室温放置
20min
,期间平衡超滤管。再离心
10min
。倒
出残留的
NaOH
溶液,将管芯浸入
MilliQ
水的烧杯
(1
或
2L)
中
,
放置几个小时
,
再换新的水
,
放置几个小时,不断稀释
NaOH
浓度。
50ml
管和盖子用自来水洗,内壁再用
MilliQ
水洗干
净。
9
、取出浸没的管芯,加至接近满的
MilliQ
水,
50ml
管也加满
MilliQ
水,将管芯慢慢
放入
50ml
离心管,排出部分水,然后盖上盖子,放
4
度保存,直到下次使用。一般来说,
按照上述步骤和注意事项,每根管用三四年不会坏。